NEJM综述：大海捞针不是梦——液体活检在肿瘤诊治中的应用
焦晓栋，臧远胜*
海军军医大学附属长征医院肿瘤科
*通讯作者
传统的肿瘤诊治过程中，基于肿瘤组织的病理诊断及相关分子检测一直是临床医生诊断和治疗的金标准。随着技术的进步，液体活检，尤其是以外周血为主的游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）检测越来越多地进入了临床医生的视野，正在悄然改变着临床实践。
然而，究竟何为液体活检？液体活检可以使用哪些样本？液体活检需要注意哪些问题？液体活检临床应用的优势和局限性在何处？液体活检能够应用在哪些方面？这些问题在临床医生的脑海里未必有完整和清晰的概念。
哈佛医学院麻省总医院的Ryan Corcoran和Bruce Chabner对此问题进行了综述（Application of Cell-free DNA Analysis to Cancer Treatment），系统地梳理了cfDNA的理论基础、技术要点和临床应用问题。该综述发表于2018年11月1日出版的《新英格兰医学杂志》（NEJM）。在此，我们邀请了海军军医大学附属长征医院肿瘤科臧远胜主任进行解读。《NEJM医学前沿》将于11月9日在APP和官网发布全文翻译。
1、液体活检的样本及检测对象
液体活检（liquid biopsy）通常指对外周血cfDNA的分析，也包括从血液或其他体液中分离和分析肿瘤衍生物质。液体活检的检测样本包括血液、尿液、粪便、脑脊液、唾液、胸水和腹水（注：遗憾的是文中并未提及心包积液，肿瘤所导致的心包积液也可以作为液体活检的样本）（图1）。液体活检的检测对象主要是cfDNA，除此之外还可以检测循环肿瘤细胞、外泌体（包含蛋白质和遗传物质的小囊泡）以及RNA。
图1. 液体活检的检测样本（来源：N Engl J Med 2018;379:1754-65）
2、cfDNA的定义及其特性
cfDNA是血液中细胞成分之外的小片段DNA，最早于1948年由Mandel 和Metais提出[1]。理论上认为cfDNA是细胞凋亡或坏死后释放入血的，通常其长约150到200个碱基对，半衰期约0.5-1小时。在正常人体中，cfDNA含量极微，通常为10-15 ng/ml，而肿瘤患者的cfDNA含量明显升高。肿瘤患者中，外周血所测得的肿瘤所释放的DNA又称为循环肿瘤DNA（ctDNA，circulating tumor DNA），ctDNA是cfDNA的一部分。肿瘤患者中，ctDNA占cfDNA的比例差异巨大，少至0.1%，多到超过90%。
1、合格的样本——液体活检的基础
在液体活检的临床应用中，合格的样本是获得准确结果的基础。由于cfDNA的半衰期极短，仅仅0.5-1小时，因此在临床采样后需要尽快分离抽提后进行检验（1-4小时），否则将会大大增加检测的假阴性率。而这样的时间要求在临床实践中极难达到。好在目前临床上进行液体活检时多采用专门的cfDNA采血管，其中含有DNA保护剂和细胞稳定剂，既能够减少cfDNA的降解，还可以避免血细胞破裂所导致的正常DNA稀释ctDNA，可常温下保持cfDNA稳定7-14天，极大地便利了液体活检的临床应用。
《中华医学杂志》于2015年12月8日发表的《非小细胞肺癌血液EGFR检测中国专家共识》中也明确提出“为了采集到最佳血浆标本用于后续提取游离DNA进行EGFR基因突变检测，建议使用如下两种方法之一采集10 ml全血并进一步分离血浆：（1）用含有游离DNA保护剂及防细胞裂解保护剂的专用常温采血管采集全血后轻摇混匀，常温（6-30℃）放置不超过5-7天。（2）用常规EDTA抗凝管（严禁使用肝素抗凝管）采集全血后，两小时内以足够的离心力将全血充分低温离心两次，分离出不含细胞成分的血浆，放置于-70℃冻存直至DNA抽提，或直接进人DNA抽提步骤”。
确保检测样本质量这一点在液体活检的临床应用中尤为重要。临床医生往往会忽视“抽血”这件“小事”，而由于采样的试管选择不当、样本储存不当、处理不及时均会导致液态活检的样本质量不合格，进而所导致的检测结果假阴性在临床上屡见不鲜，临床医生需要熟知并在临床应用中给予足够的重视。
2、敏感的方法——液体活检的关键
由于cfDNA在外周血中的含量极低，必须有足够敏感的检测方法才能够达到检测的目的。目前，满足cfDNA检测的方法包括基于聚合酶链反应（PCR）的BEAMing方法或微滴式数字PCR方法（ddPCR），此类方法可以检出0.01%或更少的等位基因频率的变化。此外，近些年进展更为迅速的二代测序方法（包括全基因组测序、全外显子测序和目标基因测序）也是液体活检的有力武器，通过barcode的方法大大提高了二代测序的准确性和敏感性（图2）。
图2. cfDNA的提取及检测方法的敏感性（来源：N Engl J Med 2018;379:1754-65）
3、靠谱的结果——临床医生的信心
说一千道一万，通过液体活检获得靠谱的结果，从而指导临床应用是检测的最终目的。在液体活检临床应用的早期，质疑的声音不绝于耳，其理由非常充分：液体活检与组织活检的一致率太低[2]。尤其是约翰霍普金斯大学医学院的两位研究人员在JAMA Oncology上发表研究指出，不同机构进行的检测得到的结果差异非常大，两家权威机构同时检测的40名患者样本中，除去6例检测结果被认为无效的外，其余34例中测序结果完全一致的只有12例[3]！这在学界掀起了一股对液体活检质疑的声音。其中原因较为复杂，既有患者选择的问题，也有组织异质性的问题。例如组织活检与液体活检的采样时间不一致；治疗后采血故cfDNA含量过低，导致液体活检检测结果阴性；选择患者的肿瘤负荷低，导致外周血cfDNA浓度低于检测阈值等等。在后期，学界意识到了这些问题并加以规避后，更大规模的研究结果证实液体活检与组织活检相比，其一致率在80-90%，尤其是对于治疗有重要意义的驱动基因，其阳性率更高[4-6]，液体活检才终于沉冤得雪。
当然，我们不可回避的现实是在临床实践中，的确有15%左右的患者外周血cfDNA含量过低，无法达到检测阈值，这部分患者必须依赖组织活检。此外组织活检所能够提供的病理学诊断以及蛋白表达的检测仍然是液体活检无法提供的重要信息。
这些信息提示我们，在临床选择液体活检时，对患者的筛选非常重要。笔者所在中心在临床上也观察到了肿瘤负荷大、外周血肿瘤标记物显著升高的患者液体活检阳性率更高的现象。另外，液体活检不能替代病理诊断，获取足够的组织明确病理仍然是肿瘤内科治疗的基础。
液体活检与组织活检相比，具有相当显著的临床应用优势：第一，无创，尤其适用于难以获得肿瘤组织的情况；第二，克服肿瘤异质性所导致的穿刺结果片面性；第三，可以监测临床无明确肿瘤病灶的患者。在临床上，主要应用于以下几种情况。
1、发现患者的基因突变。如前所述，目前液体活检客观描述肿瘤基因学的变化已经得到了诸多研究的证实。与传统的组织活检相比较，液体活检既有较高的一致率，还有其独特的无创、发现肿瘤异质性等优势，其正在改变着临床实践。
2、监测抗肿瘤治疗效果。尽管不同瘤种和个体间cfDNA的差异巨大，但在同一个个体中，cfDNA的变化能够较好地反映治疗的疗效。尤其是cfDNA的半衰期短，可以在治疗起效后1到2周迅速下降，较传统的CEA、CA199等肿瘤标记物更加敏感。
3、发现耐药性和异质性。抗肿瘤治疗过程中，不可避免地出现耐药，此时寻找耐药原因至关重要。而疾病进展时，通过二次活检获得组织标本并非易事。此时，通过液体活检，发现耐药和亚克隆的形成，能够指导后续用药方案的制定。
4、发现术后残留微病灶。对于根治性切除术后的肿瘤患者，是否能够从后续的辅助化疗中获益仍无满意的预测手段。例如对于II期结肠癌术后，研究表明手术后数周内cfDAN检测阳性的患者，无一例外出现肿瘤进展[7]，对于此类患者进行辅助化疗，无疑会对患者的预后产生积极的作用（图3）。
图3. 液体活检指导术后辅助治疗（来源：N Engl J Med 2018;379:1754-65）
5、早期诊断亚临床肿瘤。对于健康的无症状人群，应用液体活检早期诊断肿瘤如获成功，则“滴血验癌”将成为现实，无疑是液体活检最具吸引力之处。目前在这方面的应用探索正在进行，特别值得称赞的是中国学者在无症状人群中抽血检测EB病毒DNA进行鼻咽癌的早期筛查，在EBV阳性的人群中，超过10%的无症状人群发现鼻咽癌[8]。另外一项联合cfDNA和蛋白质检测的Cancer SEEK研究诊断肿瘤的敏感性在69-98%之间，特异性为99%[9]。这些研究都充分展现了液体活检在无症状人群中早期诊断肿瘤的潜在价值。
随着技术的进步，液体活检给临床医生带来了更多的疾病信息，是精准医学时代为患者选择更加合适药物的基础。前期的大量研究证实了液体活检的可靠性，在肿瘤的分子检测、疗效评估、术后辅助治疗方案的制定等方面展现出了满意的疗效，值得临床医生探索和应用。但同时，我们也需要认识到液体活检无法替代病理诊断以及15%的晚期肿瘤患者外周血cfDNA在检测阈值以下的局限性，正确合理地使用这一新兴技术，为肿瘤患者寻求更精准的治疗方法。
专家介绍
臧远胜，医学博士，副主任医师，副教授，硕士生导师。现任海军军医大学附属长征医院肿瘤科主任，长征医院国家药物临床试验机构肿瘤专业组组长。兼任中国宋庆龄基金会肿瘤区域医疗与产学联盟副理事长，中国医药教育协会免疫治疗专业委员会常务委员，中国医药教育协会盆腔肿瘤专业委员会常务委员，中国临床肿瘤学会非小细胞肺癌专家委员会委员，中国临床肿瘤学会胆道肿瘤专家委员会委员，中国临床肿瘤学会智慧医疗专家委员会委员，中国抗癌协会肿瘤防治科普专业委员会委员。获上海市科技进步三等奖1项，荣立个人三等功。
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参考文献
[1] Mandel P, Metais P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l'homme. C R Seances Soc Biol Fil 1948;142:241-3.
[2] Chae YK, Davis AA, Carneiro BA, et al. Concordance between genomic alterations assessed by next-generation sequencing in tumor tissue or circulating cell-free DNA. Oncotarget 2016;7:65364-73.
[3] Kuderer NM, Burton KA, Blau S, et al. Comparison of 2 Commercially Available Next-Generation Sequencing Platforms in Oncology. JAMA Oncol 2017;3:996-8.
[4] Adalsteinsson VA, Ha G, Freeman SS, et al. Scalable whole-exome sequencing of cell-free DNA reveals high concordance with metastatic tumors. Nat Commun 2017;8:1324.
[5] Zill OA, Greene C, Sebisanovic D, et al. Cell-Free DNA Next-Generation Sequencing in Pancreatobiliary Carcinomas. Cancer Discov 2015;5:1040-8.
[6] Schrock AB, Pavlick D, Klempner SJ, et al. Hybrid Capture-Based Genomic Profiling of Circulating Tumor DNA from Patients with Advanced Cancers of the Gastrointestinal Tract or Anus. Clin Cancer Res 2018;24:1881-90.
[7] Diehl F, Schmidt K, Choti MA, et al. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics. Nat Med 2008;14:985-90.
[8] Chan KCA, Woo JKS, King A, et al. Analysis of Plasma Epstein-Barr Virus DNA to Screen for Nasopharyngeal Cancer. N Engl J Med 2017;377:513-22.
[9] Cohen JD, Li L, Wang Y, et al. Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test. Science 2018;359:926-30.
版权信息
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